English version.Introduction à l’électrochimie de films protéiques
Les enzymes travaillent! Elles catalysent des réactions chimiques. Et depuis plus de cent ans, étudier un mécanisme enzymatique c’est faire de la cinétique, c’est à dire étudier les vitesses des réactions catalysées.
Dans le cadre des études de mécanismes d’enzymes rédox, l’électrochimie directe de protéines (ou PFV = protein film voltammetry) est un outil particulièrement puissant. Cette technique, que nous contribuons à développer, a été inventée par Fraser Armstrong (à Oxford) et utilisée pour étudier des enzymes depuis seulement une quinzaine d’années.
A Marseille, nous l’utilisons en complément des résultats obtenus par des approches plus conventionnelles. Cette collaboration avec des biologistes moléculaires, des spectroscopistes, des cristallographes, nous permet d’étudier les relations structure-fonction dans plusieurs familles d’enzymes “complexes” (i.e. multicentrées) (voir ici une liste de projets).
Voici une introduction à l’électrochimie directe, où nous nous servons de l’hydrogénase comme exemple pour expliquer ce qu’est cette technique les raisons qui font qu’elle est utile lorsqu’on cherche à comprendre le mécanisme d’une enzymes rédox.
Hydrogénases.
Les hydrogénases
sont des métalloenzymes “complexes” (elles contiennes plusieurs
centres rédox) qui catalysent l’oxydation du dihydrogène en protons et
électrons, ou bien la réaction inverse de formation de
H2. Détails. Image plus
grosse.
H2 = 2H+ + 2e-
Cette réaction chimique se produit au niveau d’un site actif qui est enfoui au coeur de la protéine, et les électrons sont transférés vers un partenaire rédox le long d’un chapelet d’agrégats fer-soufre.
Mesurer l’activité hydrogénase: la méthode classique.
On explique facilement la PFV en comparant cette technique à la méthode classique de mesure d’activité hydrogénase (en solution).
En cinétique homogène la solution d’hydrogénase est placée dans la cuvette d’un spectro optique, en présence de H2 et d’un partenaire rédox soluble oxydé (ou “médiateur”), qui accepte les électrons résultant de l’oxydation enzymatique de H2. Le médiator change de couleur quand il est réduit (e.g. le méthyl viologène devient bleu) et la cuvette du spectro aussi. La vitesse de turnover de l’enzyme est déterminée en mesurant la vitesse de variation de l’absorbance de la solution.
Cette technique a des avantages certains.
- Elle est facile à mettre en oeuvre.
- Elle permet de mesurer des activités enzymatiques même lorsqu’elles sont petites (il suffit alors d’augmenter la concentration en enzyme jusqu’à ce que la variation d’absorbance soit suffisamment rapide).
Mais elle a des inconvénients:
- Mesurer l’activité prend plusieurs minutes (jusqu’à 15 ou 20), pendant lesquelles l’activité ne doit pas varier.
- De plus, cette mesure n’est pas compatible avec la présence d’oxygène dans la solution (O2 oxyderait rapidement et directement le médiateur) alors que justement, un thème de recherche très actuel est l’étude d’hydrogénases qui peuvent fonctionner en présence d’air.
- Enfin, il n’est pas facile d’utiliser des substrats ou inhibiteurs gazeux (H2, O2, CO), à moins qu’on veule seulement maintenir leur concentration égale à celle obtenue à l’équilibre avec une atmosphère de gaz pur.
Mesure électrochimique “classique” de l’activité hydrogénase.
En électrochimie, on peut détecter la consommation du partenaire rédox via le courant de réduction qui résulte de son recyclage électrochimique sur l’électrode; dans ce cas, seul le médiateur interagit avec l’électrode, et le processus de catalyse homogène qui se produit dans le bulk de la cellule électrochimique est essentiellement le même que dans la mesure d’activité en solution. Un exemple.
Ce n’est pas ce que nous faisons!
Utiliser l’électrochimie directe.
Nous nous intéressons à une
troisième configuration initialement appelée ``protein film
voltammetry’’ (PFV), où l’enzyme est adsorbée sur une électrode et le
transfert d’électrons est direct. Si le potentiel d’électrode est
approprié, les électrons issus de l’oxydation de l’hydrogène sont
reçus sur l’électrode, et le courant mesuré est proportionnel à
l’activité spécifique de l’enzyme (la fréquence de turnover, le nombre
de molécules de H2 oxydées par unité de temps).
courant = activité x quantité d’enzyme adsorbée
Idéalement, le transfert d’électron interfacial est rapide, et l’électrode sur laquelle l’enzyme est adsorbée est tournée à grande vitesse pour éviter les limitations dûes au transfert de masse (diffusion du substrat vers l’électrode). De cette façon, le courant informe sur des propriétés intrinsèques de l’enzyme.
La PFV a une limitation évidente et un inconvénient majeur:
- Toutes les enzymes rédox ne s’adsorbent pas sur des électrodes.
- D’autre part, comme le plus souvent on ne connaît pas la quantité d’enzyme adsorbée, on ne peut pas déduire l’activité absolue de l’enzyme de la mesure du courant.
Ça commence mal?
Mais cette technique a des avantages qui compensent largement ces inconvénients:
L’information est acquise à partir de variations relatives d’activité.
En électrochimie directe, la valeur absolue de l’activité spécifique peut rarement être déterminée (et jamais précisément), par contre les variations relatives de courant informent sur des variations relatives d’activité, qui peuvent résulter d’une variation de conditions rédox (potentiel d’électrode), ou de la variation de la concentration en substrat ou en inhibiteur, ou encore du fait que l’enzyme s’active ou s’inactive au cours du temps.
Le potentiel d’électrode est un nouveau paramètre de contrôle en cinétique enzymatique.
En cinétique homogène,
la force motrice (qui dépend de la concentration en partenaire rédox)
ne peut pas être variée aisément. En électrochimie directe au
contraire, le potentiel d’électrode est un paramètre de contrôle
naturel.
En changeant le potentiel d’électrode, on change l’état rédox de l’enzyme, et le voltammogramme (le tracé du courant en fonction du potentiel) contient l’information sur la façon dont l’activité de l’enzyme dépend de son état rédox. C’est évidemment une information importante qui ne peut pas être obtenue à partir de mesures d’activité en solution.
Le profil activité/potentiel a souvent une forme complexe, qui peut quelquefois être modélisée pour obtenir des informations détaillées sur la séquence d’évènements qui se produisent au cours du cycle catalytique. Un exemple.
Haute résolution temporelle de la mesure d’activité.
En cinétique homogène, mesurer l’activité prend du temps. Typiquement 15 à 20 minutes. En électrochimie, la mesure est virtuellement instantanée, et elle peut être répétée chaque fraction de seconde. C’est évidemment très utile si cette activité varie au cours du temps, par exemple parce que l’enzyme est en train de s’inhiber ou de s’(in)activer.
Nous utilisons des expériences de chronoamperométrie (le potentiel d’électrode est constant et le courant est mesuré en fonction du temps) pour étudier en détail les cinétiques de ces processus.
Manipulation aisée de substrats et inhibiteurs gazeux.
Dans l’étude des hydrogénases, on peut avoir besoin de mesurer l’activité en fonction de la concentration en substrat (H2) ou en inhibiteur (e.g. CO). Mais il est difficile de maintenir leurs pressions partielles constantes dans la cuvette de spectro optique.
Depuis 2004, nous avons développé et utilisé toute une série de méthodes qui permettent d’utiliser l’électrochimie directe pour déterminer comment les vitesses de turnover ou d’inhibition dépendent des concentrations en substrats et inhibiteurs gazeux.
Ces méthodes sont basées sur la mesure de l’activité en fonction du temps (en chromoampérométrie) au cours d’expériences où l’on force les concentrations en substrat et inhibiteur à changer continuellement. La concentration en gaz dissous est variée simplement en balayant la cellule électrochimique avec un autre gaz.
Par exemple pour mesurer
le Km de l’hydrogénase pour l’H2, on peut mesurer l’activité sous
une atmosphère d’H2 put, puis, à partir d’un certain temps 0, on
fait buller de l’argon dans la cellule. l’argon chasse l’H2, dont la
concentration diminue. La variation d’activité en fonction du temps
contient l’info sur comment l’activité dépend de la concentration en
H2 dissous. On voit ci contre un exemple avec l’ hydrogénase
NiFe sauvage de D. fructosovorans et un
double mutant (L122M-V74M) dont le Km est beaucoup plus grand.
Il n’est pas nécessaire de mesurer indépendamment la concentration en gaz dissous parce que de nombreuses expériences de contrôle ont démontré que la décroissance de la concentration est exactement exponentielle. La modélisation des données est alors particulièrement aisée. En lire plus
L’O2 n’interfère pas avec la mesure d’activité hydrogénase.
Les mesures d’activité hydrogénase en solution ne sont pas compatibles avec la présence d’oxygène, parce que celui ci oxyde directement le partenaire rédox. En électrochimie, pourvu que le potentiel d’électrode soit suffisamment élevé, l’oxygène n’est pas réduit sur l’électrode, et il n’interfère donc pas avec la mesure d’activité.
C’est pour cette raison
que l’électrochimie directe est utilisée étudier les mécanismes
d’inactivation aérobie de l’enzyme. Par exemple, la figure ci contre
montre comment l’activité de l’ hydrogénase
FeFe de la bactérie C. acetobutilycum évolue
en fonction du temps (panel du bas) quand l’enzyme est exposée
transitoirement à l’oxygène (le panel du haut montre la concentration
en oxygène en fonction du temps). En analysant ce genre de résultats,
nous avons pu donner une image très précise du mécanisme
d’inactivation de l’enzyme. En lire
plus.
Site info: © 2007-2009 C. Léger | Generated by webgen | Design original de Andreas Viklund.