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Thèse Julia RENDON

par Webmaster - publié le , mis à jour le

Julia Rendon a soutenu sa thèse intitulée "Etudes structurales et fonctionnelles de la nitrate réductase A par spectroscopie RPE à haute résolution" le 13 décembre à 14h, devant le jury composé de

- Dr. Pierre DORLET (Rapporteur)
- Dr. Carole DUBOC (Rapportrice)
- Pr. Petra HELLWIG (Examinatrice)
- Pr. Stéphane VIEL (Examinateur)
- Pr. Bruno GUIGLIARELLI (Directeur de thèse)
- Dr. Stéphane GRIMALDI (HDR,co-directeur de thèse)
- Dr. Axel MAGALON (membre invité)

résumé en français :
L’objectif de mon travail de thèse consiste à élucider à l’échelle moléculaire le fonctionnement des systèmes enzymatiques complexes impliqués dans des processus de conversion d’énergie chez les êtres vivants. Je m’intéresse en particulier à la compréhension de deux étapes clés du fonctionnement commun à un grand nombre de ces systèmes, à savoir (i) les étapes d’interaction de ces complexes avec les quinones membranaires et (ii) les mécanismes catalytiques au niveau des sites actifs à molybdène. Le système catalytique modèle que j’étudie est la nitrate réductase A (NarGHI) issue de la bactérie Escherichia coli, en collaboration avec l’équipe du Dr. Axel Magalon (Laboratoire de Chimie Bactérienne, Marseille). Il permet la respiration anaérobie en utilisant le nitrate comme accepteur terminal d’électrons alternatif à l’oxygène et joue un rôle important dans le cycle biogéochimique de l’azote en catalysant la réaction de réduction du nitrate en nitrite. Ma recherche vise en particulier à identifier les facteurs moléculaires qui permettent d’ajuster la réactivité de ces systèmes. Cela nécessite l’obtention d’informations structurales à l’échelle atomique sur ces complexes macromoléculaires. La stratégie que j’ai utilisée a consisté dans un premier temps à générer des intermédiaires paramagnétiques clefs du fonctionnement de ces systèmes (radicaux semiquinones ou ion Mo(V)). Puis j’ai caractérisé leurs propriétés d’oxydoréduction par potentiométrie rédox suivie par spectroscopie RPE. Enfin, j’ai utilisé les techniques de spectroscopie RPE impulsionnelle à haute résolution, notamment la spectroscopie de corrélation des sous niveaux hyperfins (HYSCORE) pour sonder l’environnement magnétique local de ces intermédiaires à travers la détection des interactions nucléaires hyperfines et quadripolaires qui sont trop faibles pour être visibles par spectroscopie RPE classique.
Dans une première partie de mes travaux j’ai notamment démontré qu’une espèce déméthylménasemiquinone est stabilisée par la nitrate réductase dans le même site protéique que les deux autres types de quinones synthétisées par E. coli, précédemment caractérisées dans l’équipe. Nos résultats mis en regard avec les données actuelles disponibles sur les propriétés rédox des démethylménaquinones non liées indiquent une affinité du site dépendant de l’état rédox de l’intermédiaire, un comportement inhabituel non observé pour les autres quinones.
Dans une seconde partie je me suis intéressée à élucider la structure des intermédiaires haut et bas pH du MoV stabilisées dans le site actif de NarGH. Pour cela, la stratégie mise en place a été de combiner les approches par RPE et potentiométrie rédox à diverses stratégies d’enrichissement isotopique en noyaux 15N et/ou 98Mo de NarGH ou encore de marquage sélectif 15N ainsi qu’à la modélisation de ces interactions et la simulation spectrale. Nos résultats ont permis de mieux comprendre le mécanisme à l’origine de la coexistence des deux formes spectrales du MoV, de déterminer les différences structurales entre ces deux espèces, ainsi que de sonder les modifications structurales induites par la présence du substrat.
Ces stratégies expérimentales et de modélisation permettent d’obtenir une meilleure compréhension du rôle de l’environnement protéique dans l’ajustement fin de la réactivité des complexes bioénergétiques vis-à-vis de leurs substrats.

résumé en anglais :
The aim of my work is to elucidate at the molecular level the structure and the function of enzymes involved in energy conversion processes in living organisms. In particular, it is focused on the understanding of two important steps found in many of these systems, namely (i) their interaction with membrane quinones acting as electron/proton shuttles and (ii) the catalytic mechanism at the molybdenum active site. The nitrate reductase A (NarGHI) from the bacterium Escherichia coli is used as a model for these studies. This membrane-bound complex reduces nitrate into nitrite during anaerobic respiration and plays therefore an important role in the global nitrogen cycle. The goal of my research is mainly devoted to the identification of the molecular factors tuning the reactivity of this system at the two active sites. For this purpose, I mainly relied on the structural characterization of key paramagnetic intermediates e.g. semiquinone radicals or Mo(V) ion using electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy in combination with redox potentiometry. High resolution pulse EPR methods, especially Hyperfine Sublevel Correlation (HYSCORE) spectroscopy, were used to probe their local environment through the detection of hyperfine (and eventually quadrupole interactions) to nearby magnetic nuclei that are otherwise too weak to be measurable in conventional continuous wave EPR spectroscopy.
In the first part of my work I have shown that a demethylmenasemiquinone intermediate can be stabilized in NarGHI within the same binding site as the two other types of respiratory quinones synthesized by E. coli, namely ubiquinones and ménaquinones, previously characterized in the group. Compared to currently available data on the redox properties of unbound demethylmenaquinones, my results indicate that the binding affinity of demethylmenaquinone to NarGHI depends on the coenzyme redox state, a behavior not observed for the other two quinones.
In a second part, I have elucidated the structure of the high and low pH MoV intermediates stabilized at the NarGH active site by combining the use of continuous wave and pulsed EPR spectroscopy with several single or multiple isotopic enrichment strategies in 15N or 98Mo nuclei, spectral simulation and DFT modeling. The results shed light on the mechanism underpinning the coexistence of these two MoV spectral forms, their structural relationship, and the changes induced by the substrate. Altogether, this work provides new data for an in-depth understanding of the role of the protein environment in fine-tuning the reactivity of bioenergetic complexes toward their substrates.