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Thèse de Mériem Merrouch

par Webmaster - publié le , mis à jour le

Mériem MERROUCH a soutenu avec succès sa thèse intitulée "Mécanisme, maturation et biodiversité d’une enzyme à cofacteur NiFe, importante dans le contexte de l’énergie et de l’environnement : la carbone monoxyde déshydrogénase",

le mercredi 25 Octobre 2017 à 10h dans l’amphithéâtre Pierre DESNUELLE

devant le Jury composé de
- Béatrice GOLINELLI (Rapportrice)
- Vincent NIVIERE (Rapporteur)
- Corinne AUBERT (Examinatrice)
- Petra HELLWIG (Examinatrice)
- Jalila SIMAAN (Examinatrice)
- Sébastien DEMENTIN (Directeur de thèse)
- Pierre-Pol LIEBGOTT (Co-directeur de thèse)
- Vincent FOURMOND (Invité)

Résumé Français :

Les CO-Déshydrogénases (CODH) catalysent l’oxydation réversible du CO en CO2 selon la réaction : CO + H2O ↔ CO2 + 2e- + 2H+ . Le site actif des CODH homodimériques isolées d’organismes anaérobies est constitué d’un centre [Ni-4Fe-4S]. La CODH contient 3 autres centres Fer-soufre dont un est à l’interface entre les deux monomères. Nous avons étudié différents aspects de la réactivité de CODHs provenant de divers micro-organismes : leur fonction physiologique, la maturation de leur site actif, leur mécanisme catalytique et leur réactivité vis-à-vis de l’O2.
Ces enzymes sont réputées être « extrêmement » sensibles à l’O2, cependant le mécanisme d’inactivation par l’oxygène n’est pas connu. Nous avons étudié par électrochimie directe l’effet de l’oxygène sur différentes CODHs et montré que l’oxygène inhibe rapidement le site actif, mais qu’il est possible de réactiver l’enzyme partiellement ou totalement après réactivation. Nous avons également démontré que cette réactivité varie d’une CODH à l’autre.
Afin de caractériser la chaîne de transfert d’électron de la CODH de Desulfovibrio vulgaris Hildenborough, nous avons analysé par des approches biochimiques, électrochimiques et spectroscopiques différents mutants de la CODH. Nous avons, par mutagénèse dirigée, modifié le centre [2Fe-2S] interfacial soit pour le convertir en centre [4Fe-4S] soit pour l’éliminer complètement. Nos résultats montrent que la sensibilité vis-à-vis de l’O2 des CODH ne dépend pas de la nature de ce centre fer-soufre, mais qu’étonnamment sa présence favorise l’insertion du nickel au site actif.
Pour comprendre la fonction de la protéine accessoire CooC dans la maturation du site actif de la CODH de Desulfovibrio vulgaris Hildenborough, nous avons entrepris différentes approches pour produire cette maturase et nous avons comparé les structures cristallographiques des CODHs produites en présence ou en absence de la maturase. Nos données sont cohérentes avec les résultats obtenus précédemment : CooC est nécessaire à l’insertion du nickel.
Certains microorganismes s’appuient sur la CODH pour utiliser le CO comme seule source de carbone et d’énergie. Ce n’est pas le cas de Desulfovibrio vulgaris Hildenborough, mais cette bactérie consomme le CO lorsqu’il est ajouté au milieu. Nous avons remis en question l’hypothèse que la CODH a un rôle dans la détoxification, en montrant que la CODH confère un avantage physiologique à Desulfovibrio vulgaris Hildenborough en absence de CO, et est importante dans le métabolisme énergétique et la production de biomasse dans certaines conditions.

Résumé Anglais :

CO-dehydrogenases (CODH) catalyze the reversible reduction of CO2 to CO : CO2 + 2e- + 2H+ ↔ CO + H2O. CODH are homodimeric enzymes which contain an inorganic [Ni-4Fe-4S] active site and three iron-sulfur clusters, among which one is at the interface of the two monomers. We studied various aspects of CODH from different micro-organisms, including their physiological function, maturation of their active site, their catalytic mechanism, and their reactivity with O2.
CODHs are deemed to be “extremely” sensitive to O2. However, no studies related to the mechanism of inhibition of CODHs by O2 have been conducted so far. We use protein film voltammetry to study the effect of O2 on different CODHs and we have shown that CODHs are strongly inhibited by O2 but that the inactivation can be partially or completely reverted by reduction. Moreover, the extent of reactivation varies from one CODH to the other.
To characterize the iron sulfur clusters chain of CODH from Desulfovibrio vulgaris Hildenborough, we studied by biochemical, electrochemical, and spectroscopic approaches, different mutants of CODH. By site-directed mutagenesis, we modified the [2Fe-2S] cluster at the interface of the two monomers to converted it to a [4Fe-4S] cluster or to deleted it altogether. We have shown that oxygen sensitivity does not depend on the nature of this iron-sulfur cluster and that, surprisingly, its presence determines the insertion of nickel into the active site.
To understand the function of the accessory protein CooC in the maturation of the active site of CODH, we used several approaches to produce CooC from Desulfovibrio vulgaris Hildenborough and compared the crystallographic structures of CODH produced in absence or in presence of CooC. Our data are consistent with those previously obtained : CooC is essential for nickel insertion into the active site of CODH.
Some organisms grow on CO as sole source of carbon and energy by using CODH. This is not the case for Desulfovibrio vulgaris Hildenborough. This bacterium consumes CO when added in the growth medium, which lead to a proposed role of detoxification. In the laboratory, however, we have shown that CODH from Desulfovibrio vulgaris Hildenborough confers physiological advantages in the absence of CO and is important for energy metabolism and biomass production under certain conditions.