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Maryam SEIF EDDINE a soutenu sa thèse lundi 12 novembre 2018

par Laure Azzopardi - publié le , mis à jour le

" Etude des interactions des quinones avec le complexe respiratoire nitrate réductase
par spectroscopie RPE à haute résolution"

Lundi 12 novembre 2018 14h00, dans l’Amphithéâtre "Pierre Desnuelle" CNRS - 31 chemin Joseph Aiguier – Marseille

Composition du Jury :
Dr. Carole DUBOC, Rapporteur
Dr. Serge GAMBARELLI, Rapporteur
Dr. Sylvie CHOUA, Examinatrice
Pr. Frédéric FAGES, Examinateur
Dr. Axel MAGALON, Invité
Pr. Bruno GUIGLIARELLI, Directeur de Thèse
Dr. Stephane GRIMALDI, Co-directeur de Thèse

RESUME

Les quinones sont des molécules organiques lipophiles jouant un rôle très important dans les processus de respiration cellulaire dans la plupart des organismes vivants grâce en particulier à leur capacité de transférer des électrons et des protons entre les enzymes membranaires des chaînes respiratoires. Pour cela, les quinones s’intègrent dans des sites spécifiques (sites Q) de ces enzymes via la formation de liaisons hydrogène avec la protéine. Un modèle enzymatique bien adapté pour élucider les facteurs moléculaires pilotant la réactivité des sites Q au sein des enzymes respiratoires est la nitrate réductase membranaire (NarGHI) de la bactérie modèle Escherichia coli. Il a été montré récemment par l’équipe la capacité de cette enzyme à fixer au sein du même site (site QD, à proximité de l’hème bD), les trois quinones respiratoires endogènes présentes dans les membranes de la bactérie (Ubiquinone UQ, Ménaquinone MK et Déméthylménaquinone DMK) et qui possèdent différentes structures et différentes propriétés d’oxydoréduction. Dans ce contexte, mon travail de thèse a consisté à caractériser les modes de fixations et d’interactions des quinones avec l’enzyme NarGHI. Dans un premier temps j’ai participé à la mise en place d’une nouvelle stratégie d’enrichissement isotopique spécifique du groupement méthyle de la MK couplée à l’observation par RPE haute résolution des signaux de ce groupement dont le couplage hyperfin de ces protons avec le radical constitue une sonde efficace du mode de fixation de la semiquinone dans son site. Un modèle basé sur des calculs DFT a alors pu être proposé pour la ménasemiquinone fixée au sein du site QD. Ensuite j’ai caractérisé en détails le mode de fixation de DMSKD ce qui m’a permis de mettre en évidence un changement de conformation de la chaine isoprényle de DMSKD par comparaison à celle de MSKD. Les paramètres d’interaction hyperfine entre le radical et les deux protons β-méthylène ont pour la première fois été distingués puis déterminés par analyse des spectres RPE haute résolution. De plus, la mise en place d’expériences d’ENDOR de Davies de la DMSKD m’a permis de mettre en évidence et de caractériser la présence d’au moins deux liaisons hydrogène avec DMSKD. D’autre part, l’analyse par spectroscopie RPE des titrages d’oxydoréduction de membranes bactériennes purifiées préparées à différents pH m’a permis de proposer plusieurs modèles de dépendance des potentiels redox de DMSKD en fonction du pH. Enfin, l’analyse par potentiométrie redox des mutants du site QD suivie par spectroscopie RPE m’a permis d’appréhender le rôle crucial de deux acides aminés dans la stabilisation des espèces semiquinoniques et dans la sélectivité du site.

ABSTRACT
Quinones are lipophilic organic molecules that play a very important role in the processes of cellular respiration in most living organisms thanks to their ability to transfer electrons and protons between the membrane enzymes of the respiratory chains. For this, the quinones integrate into specific sites of these enzymes via the formation of hydrogen bonds with the protein. The binding of quinones within their sites in different respiratory enzymes has been the subject of numerous studies in different groups and laboratories around the world for decades. An enzymatic model well suited to elucidate the molecular factors driving the reactivity of Q sites in respiratory enzymes is the membrane nitrate reductase (NarGHI) of the model bacterium Escherichia coli. The team recently showed the ability of this enzyme to bind, within the same site (QD site, near the heme bD), the three endogenous respiratory quinones present in the membrane of the bacterium (Ubiquinone UQ, Menaquinone MK and Demethylmenaquinone DMK), which have different structures and oxidation-reduction properties. In this context, my PhD work consisted in characterizing the binding and interaction modes of quinones with the NarGHI enzyme. Firstly, I participated to the implementation of a new isotopic enrichment strategy specific for the methyl group of MK coupled with the observation by high resolution EPR of the signals of the methyl group, which constitutes an efficient probe of the asymmetric fixation mode of semiquinone in its site. A model based on DFT calculations could then be proposed for the quinone fixed within the QD site. Then I characterized in detail the mode of fixation of DMSKD which allowed me to highlight a conformational change of the isoprenyl chain of DMSKD compared to the MSKD. The hyperfine interaction parameters of the two β-methylene protons were distinguished and determined by analyzes of the high-resolution EPR spectra. Moreover, the establishment of Davies ENDOR experiments of the DMSKD, allowed me to highlight and characterize the presence of at least two I hydrogen bonds with DMSKD. On the other hand, analysis by EPR spectroscopy of oxidation-reduction titrations of purified bacterial membranes prepared at different pHs allowed me to propose several models of dependence of the redox potentials of DMSKD in pH. Finally, the redox potentiometry analysis of the QD site mutants followed by EPR spectroscopy allowed me to understand the crucial role of two amino acids in the stabilization of semiquinonic species and in the selectivity of the site.