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Martino Benvenuti a soutenu sa thèse le 20 décembre 2019

par Webmaster - publié le

"Etude de la biodiversité des CO-déshydrogénases à nickel"

Le Vendredi 20 décembre 2019 à 13h30

Amphithéâtre Pierre Desnuelle

Composition du jury :
* Rapporteure : Béatrice Golinelli-Pimpaneau,
* Rapporteur : Yvain Nicolet,
* Examinatrice : Francesca Valetti,
* Co-directeur de thèse : Sébastien Dementin,
* Directeur de thèse Recherches : Christophe Léger.
* Présidente du Jury : Jalila Simaan

Résumé

Les monoxyde de carbone déshydrogénases contenant du nickel (CODH) sont des enzymes qui catalysent l’interconvertion entre le CO et CO2. Celles du type CooS sont homodimériques et comportent cinq centres [FeS] : dont deux centres [4Fe4S] appelés clusters B, impliqués dans le transfert d’électrons, ainsi qu’un cluster C (le site actif), un centre [Ni4Fe4S], et enfin un cluster D pouvant être soit un centre [2Fe2S] soit un [4Fe4S], à l’interface des deux monomères.

Pendant mon doctorat, j’ai étudié différents aspects de la réactivité de la CODH de Desulfovibrio vulgaris (Dv) : sa réaction avec l’O2, sa chaîne de transfert électronique et son mécanisme d’activation. J’ai également produit pour la première fois et caractérisé les deux CODHs de l’archaebactérie thermophile Thermococcus sp AM4.

Le CODHs sont considérées comme étant très sensibles au dioxygène, et de ce fait leur purification est toujours faite en anaérobiose stricte. Cependant, nous avons observé que la CODH de Dv peut être purifiée en aérobiose et qu’après celle-ci, elle conserve, en grande partie, son activité. Nous avons découvert que cette propriété était due à la nature du cluster D.

Le cluster-D exposé à la surface de l’enzyme n’a jamais pu être observé par les méthodes spectroscopiques et son potentiel d’oxydo-réduction semble très bas. Pour la première fois, notre collaborateur, Pr. Pandelia de l’université de Brandeis (US), a réduit le cluster-D avec la dithionite et a pu le détecter par EPR et par la spectroscopie Mössbauer. Nous avons essayé de déterminer le potentiel redox des centres [FeS] de la CODH de Dv par titrage redox en spectrophotométrie UV-vis sur plusieurs variants de cette enzyme (absence de nickel dans le site actif, délétion du cluster-D ou sa transformation en [4Fe4S]). Pour toutes les protéines, nous avons observé deux transitions redox survenant au même potentiel. De ces résultats, nous en concluons que la chaîne du transfert électronique dans la CODH de Dv est très robuste, que le cluster-D reste oxydé au-dessus de -530 mV vs SHE à pH 8 et qu’enfin le nickel n’affecte pas les potentiels des deux transitions redox. D’autres expériences devront permettre de comprendre quel cluster est réduit pendant le titrage redox suivis par spectrophotométrie UV-vis.

Certaines CODHs sont purifiées sous une forme partiellement active, et leur activation requiert un traitement chimique ultérieur. L’activation de la CODH de Dv est unique et demande un traitement de l’enzyme par le NiCl2 et du dithionite de sodium. Durant mon doctorat, nous avons découvert de nouveaux protocoles d’activation pour la CODH de Dv. Ces résultats sont une base solide pour de futures investigations.

Les CODHs sont très répandues dans la nature et se retrouvent dans les règnes des bactéries et des archées. Par analyses phylogénétiques, Inoue et al. ont identifié environs 1000 séquences non redondantes dans le génome des procaryotes de protéines pouvant être des CODHs. Selon la littérature, moins de 1% de ces protéines ont été caractérisées jusqu’à présent. Les CODH bactériennes sont les plus étudiées et sont produites par des microorganismes ayant des physiologies différentes et habitant des niches écologiques diverses.

Dans l’objectif d’explorer la biodiversité de cette famille enzymatique, nous avons décidé d’étudier les CODHs de l’archée Thermococcus sp AM4 (Tc). Cette souche peut réaliser une croissance carboxydotrophique, hydrogénogénique et sulfidogénique grâce à deux CODHs encodées par deux opérons distincts, chaque opéron contient un gène codant pour une maturase CooC. Dans le génome de Tc, une troisième protéine CooC est présente hors des deux opérons codants pour les CODHs.

Après plusieurs tentatives infructueuses d’expression hétérologues chez E. coli, nous avons pu produire ces deux CODHs de Tc dans Desulfovibrio fructosovorans (Df), avec ou sans leur CooC. Nous avons démontré que les deux CODHs nécessitent une protéine CooC pour être produites dans une forme active chargée en nickel, de plus ces CooC sont interchangeables. La structure cristalline d’une Tc CooS produite en l’absence de CooC, obtenue par le Pr. Dobbek de l’Université Humboldt à Berlin (DE), appuie cette conclusion. En effet, le nickel est absent du cluster-C de cette protéine. Concernant CooC3, nous n’avons pas de preuve que cette maturase putative puisse intervenir dans la maturation d’une des CODHs.
Nous avons caractérisé les deux Tc CODHs avec des approches biochimiques et électrochimiques. Nous avons comparé plusieurs propriétés catalytiques de ces enzymes (activation, biais catalytique, le Km pour les substrats, l’effets des inhibiteurs) et les résultats sont rapportés dans un article soumis.